Journal 1ère STL – Microbiologie des plastiques

Dans un premier temps, nous avons récupéré des échantillons enterrés depuis six mois au lycée, ainsi que des échantillons de terre provenant de différents sites.
Ensuite, ces échantillons ont été découpés en petits morceaux, puis 5 mL ont été introduits dans des tubes Falcon, auxquels 15 mL de milieu nutritif ont été ajoutés. Une dilution au 1/100 a été réalisée pour l’échantillon de terre.
Après agitation pendant une heure, les suspensions ont été ensemencées sur cinq boîtes de Petri contenant différents milieux de culture (TSA, R2A, CAS, amidon et PVK). Pour chaque ensemencement, 100 µL de suspension ont été déposés à l’aide d’une micropipette, puis étalés avec un râteau.
Enfin, les boîtes ont été incubées à 30 °C pendant une nuit.

introduction: en début d’année nous avons enterré différents plastiques dans différents sol dans Strasbourg pour étudier leurs dégradations et leurs impacts sur la nature.

pour commencer nous avons parlés de la dégradation du plastique, nous avons aussi parler du contexte et établie une problématique « quel microorganisme permettent la dégradation du plastique? »
Apres cela on s’est posé des questions sur notre sujet de recherche comme, » quel est l’effet de combiner les polluants? »

On a comparés les différents types de terres et de sachets plastiques qui viennent de différents endroits:
-la forêt
-le platane du lycée Jean Rostand
-devant le bâtiment S du lycée

Suite a ça nous avons réfléchis aux différents manipulations que nous allons faire l’après midi, une identification bactérienne fonctionnelle:
-ensemencement
-dilution en cascade
-état frais

Contexte défini : la dégradations des plastiques .
La problématique soulignée : La dégradation des plastiques .
On s’est posé deux questions:
-Quelles sont les bactéries qui favorisent la dégradations des plastiques ?
-Qu’est ce qui se passe lorsqu’on combine plusieurs polluants ?
Suite à ces questions, nous avons cherché des expériences potentielles à réaliser :
Test pH – oxygène – eau – NaCl – température
ensemencement de la terre et des polluants en surface
Finalement, nous allons faire des ensemencement en surface, et pour cela nous avons donc commencé par séparer les bactéries de la terre et des polluants en les mettant en tube Falcon avec un liquide nutritif (voir images, les tubes avec le sac plastique noir n’ont pas été gardés).
Suite à cela, les bactéries obtenues ont été mise sur différents milieux de culture (TSA ; R2A ; PVK ; Amidon)

Aujourd’hui on a fait l’extraction de l’ADN présente dans les différent milieux .
On a procédé de deux manière différentes ( deux tests ):
le SPIN EASY et le Fast DNA
Notre groupe ont a fait le test Fast DNA voici les différentes étapes:
– on a pesé 0,5g des cinq terres différentes
– on les a mis dans dix tubes eppendorf différents
– on a fait le test sur cinq des échantillons et l’autre groupe a fait l’autre test(spin easy)
-on a mis les echantillons de terre dans des tubes contenant des petites billes , 978 µL de sodium et 122µL de MT buffer
-pendant 5 min on les a homogénéiser dans le vortex puis on les a mis 5 min dans la centrifuge ect..(voir protocole sur feuille donné)
Le but de cette expérience était d’extraire les différents ADN des microorganismes présent dans les terres pour pouvoir les compter plus tard et comparé les différentes technique d’extraction.

Tout d’abord, dans la matinée, nous avons dénombré les colonies de chaque boîtes de Petri. On a alors calculé le nombre de colonie par boîte ainsi que leur densité et regroupé dans un tableau.

En ce qui concerne l’après-midi, nous avons réalisé 4 expériences différentes pour les 6 échantillons, c’est-à-dire:
-Terre forêt
-Terre ( de Mylis)
-Terre ( de Tuana)
-Plastique forêt
-Amidon forêt
-Plastique lycée

Pour la première expériences, dans une boîte de Petri divisée en 2 à chaque fois et dans chacune des parties sont numérotés des points de 1 à 20, il a fallut déposer 20 colonies différentes à chaque point avec un cure-dent différent. Et ainsi répéter la manipulation pour chaque échantillon. Ce test a permis de voir si la bactérie produit des antibiotiques ce qui sera analyser plus tard.

A la deuxième expérience, dans des boîtes de Petri à nouveau, nous avons ensemencé 100µL de solution d’échantillon du jour précédent. Puis on y a ajouté à six endroits distinct de la boîte, des antibiotiques soient: Amoxicilin, Gentamicin, Aztreonam, Streptomycin, Erythromycin ainsi que Ciprofloxacin. Pour finir il a fallut les incuber à 30°C. Ce test permet de faire une identification antibiogramme.

Comme troisième étape, nous avons introduit 4 mL de chaque échantillon dans deux plaque à six puits pour pouvoir en remplir 8. Dans chaque puits il y a eut:
-l’échantillon seul pour le témoin
-l’échantillon et les 20 billes plastique
-l’échantillon et 0,1µg/mL de cuivre
-l’échantillon et 0,01µg/mL d’antibiotique
-l’échantillon, les 20 billes plastique et 0,1µg/mL de cuivre
-l’échantillon, les 20 billes plastique et 0,01µg/mL d’antibiotique
-l’échantillon, 0,1µg/mL de cuivre et 0,01µg/mL d’antibiotique
-l’échantillon, les 20 billes plastique, 0,1µg/mL de cuivre et 0,01µg/mL d’antibiotique
Ce test permet de déterminer l’antibiorésistance en combinant les polluants.

Pour finir, comme 4ème expériences, nous avons pris un plaque pour les 4 groupes et introduit 4mL de M9, 40µL de chaque échantillons dans chaque compartiments pour chaque groupes et 10 billes de plastique.
Ce test permet d’analyser la sélection des µ-organismes dégradant le plastique.

Observations des stades de dégradation du plastique en fonction du milieu où il a été enterré.
Pour le potager de Holtzheim on a un début de dégradation très légère du sachet biodégradable, aucune dégradation du sachet poubelle et du pot de yaourt, dans une terre assez humide .Pour le lycée, il y a un an dans une terre sèche, le sachet biodégradable est quasiment dégradé, le sachet poubelle n’a pas de changement et le pot de yaourt est resté intacte. Pour la forêt, le sachet biodégradable est en bonne phase de dégradation, le pot de yaourt est fragmenté donc une dégradation partielle et le sachet poubelle reste encore inchangé.
Extraction d’ADN: pour extraire l’ADN des microorganismes présents dans la terre, on a mélangé la terre pesée en amont à un premier réactif, puis vortexer et centrifuger pour faire remonter l’ADN en surface et le dépôt au fond. On a ensuite prélevé le liquide en surface pour rendre l’ADN de plus en plus pur en répétant les étapes où l’on ajoute des réactifs et utilisant des filtres pour les dernières étapes et faire apparaitre l’ADN pur des microorganismes pour effectuer la PCR par la suite.

On a mis en commun nos expériences et les analyses.
En premier temps nous avons exploiter les résultats puis, a partir de nos colonies, nous avons pu faire une coloration de gram pour étudier les différents types de bactéries (Gram +, Gram -)
En second temps, nous avons fait des antibiogrammes pour savoir si les bactéries produisent des antibiotiques.
Par la suite nous avons étudié les résultats pour savoir si les bactéries étaient antibiorésistantes.

Le kit de tests numéro 2 est de meilleure qualité que le kit de tests numéro 1 pour cette expérience car les valeurs sont plus élevées donc il y a plus d’ADN présents pour notre analyse.
L’endroit qui contient le plus de micro-organismes dans la terre est la forêt de Ostwald qui contient 15.74 ug/g de terre.

Dans le carde de notre expérience, nous utiliserons la technique PCR afin de pouvoir compter et distinguer la quantité de microorganismes présents dans les différents échantillons de terre. Ainsi on peut déterminer quels microorganismes sont présent sur les divers plastiques enterrés.

La PCR à pour principe de multiplier la quantité d’ADN pour pouvoir mieux l’observer et également déterminer quels microorganismes (bactéries, champignons, …) sont présents ou non.
Les étapes sont : la Dénaturation où l’on sépare les deux brins d’ADN, l’Hybridation où une amorce vient se fixer sur le brin d’ADN si la séquence recherché est présente sur l’ADN, puis l’Elongation ou on complète la séquence avec des nucléotides.
Ce processus se répète une trentaine de fois pour obtenir environ un milliard de copies de la séquence de l’ADN.

Voici le tableau des résultats de nos expériences

Copie de Copie de Formation enseignants Rostand 18 juin 2025 par Eléa HEBERLE